流式細胞儀主要構(gòu)造和工作原理

一. 流式細胞術(shù)概述

     流式細胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、細胞免疫學(xué)于一體, 同時具有分析和分選細胞功能。它不僅可測量細胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細胞表面和細胞漿抗原、細胞內(nèi)DNA、RNA含量等,可對群體細胞在單細胞水平上進行分析, 在短時間內(nèi)檢測分析大量細胞,并收集、儲存和處理數(shù)據(jù),進行多參數(shù)定量分析; 能夠分類收集（分選）某一亞群細胞,分選純度＞95%。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。
國內(nèi)使用的流式細胞儀主要由美國的兩個廠家生產(chǎn):BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司（簡稱B-D公司）。流式細胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機、臺式機）和綜合型（又稱大型機、分析型）。BECKMAN-COULTER公司產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外,還具有細胞分選功能,多用于科學(xué)研究。

二.流式細胞儀主要技術(shù)指標(biāo)

1．流式細胞儀的分析速度：
一般流式細胞儀每秒檢測1000～ 5000個細胞,大型機可達每秒上萬個細胞。
2．流式細胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個細胞上<600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。
3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細胞的大小,一般流式細胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。
4．流式細胞儀的分辨率：通常用變異系數(shù)CV值來表示，,一般流式細胞儀能夠達到<2.0%,這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時要求必須達到的。
   5．流式細胞儀的分選速度：一般流式細胞儀分選速度＞1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上。

三.流式細胞儀主要構(gòu)造和工作原理    流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)

流式細胞儀主要由以下五部分構(gòu)成:①流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)②激光光源及光束形成系統(tǒng)③光學(xué)系統(tǒng)④信號檢測與存儲、顯示、分析系統(tǒng)⑤細胞分選系統(tǒng)。
流動室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式細胞儀的核心部件，流動室由石英玻璃制成，單細胞懸液在細胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內(nèi)的一定孔徑的孔,檢測區(qū)在該孔的中心，細胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。流動室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動，控制鞘液流的裝置是在流體力學(xué)理論的指導(dǎo)下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成，只要調(diào)整好鞘液壓力和標(biāo)本管壓力, 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準(zhǔn)確無誤。見圖12.1流動室示意圖。流動室孔徑有60μm、100μm、150μm 、250μm等多種，供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動室。
圖12.1流動室示意圖（采自Coulter Training Guide）

 激光光源及光束形成系統(tǒng)

    流式細胞儀可配備一根或多根激光管，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長488ηm,此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633ηm）和/或紫外激光管。

流式細胞儀的主要測定信號熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號的強弱與激發(fā)光的強度和照射時間相關(guān)，激光是一種相干光源,它能提供單波長、高強度、高穩(wěn)定性的光照，正是能達到這一要求的理想的激發(fā)光光源。
    在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束（22μm×66μm），在這種橢圓形激光光斑內(nèi)激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致。

光學(xué)系統(tǒng)

流式細胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學(xué)系統(tǒng)由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個小孔）的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細胞受照強度一致，zui大限度的減少雜散光的干擾；流動室后的光學(xué)系統(tǒng)主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。濾光片主要有三類：長通濾片（LP）--只允許特定波長以上的光線通過，短通濾片（SP）-- 只允許特定波長以下的光線通過，帶通濾片（BP）-- 只允許特定波長的光線通過，不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管（PMT）,如接收綠色熒光（FITC）的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525, 接收色橙紅色熒光（PE）的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575, 接收紅色熒光（CY5）的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675。見圖12.2光學(xué)系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)示意圖。

信號檢測系統(tǒng)

    當(dāng)測定標(biāo)本在鞘流液約束下細胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時產(chǎn)生散射光和熒光信號,散射光分為前向角散射（Forward Scatter, FS）和側(cè)向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是細胞的物理參數(shù)與細胞樣本的制備（如染色）無關(guān);熒光信號也有兩種,一種是細胞自發(fā)熒光它一般很微弱,一種是細胞樣本經(jīng)標(biāo)有特異熒光素的單克隆抗體染色后經(jīng)激光激發(fā)發(fā)出的熒光，它是我們要測定的熒光,熒光信號較強,這兩種熒光信號的同時存在是我們測定時需要設(shè)定陰性對照的理由,以便從測出的熒光信號中減去細胞自發(fā)熒光和抗體非特異結(jié)合產(chǎn)生的熒光。

前向角散射（FS）反映被測細胞的大小,它由正對著流動室的光電二極管裝置接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?；?cè)向角散射或900散射（SS）反映被測細胞的細胞膜、細胞質(zhì)、核膜的折射率和細胞內(nèi)顆粒的性狀, 它由一個光電倍增管（PMT） 接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?這些電信號存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內(nèi)。

流式細胞儀測定常用的熒光染料有多種,他們分子結(jié)構(gòu)不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時必須依據(jù)流式細胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長（如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633ηm）。488ηm激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP（葉綠素蛋白）、ECD（藻紅蛋白-得克薩斯紅）等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是：
             激發(fā)光波長（ηm）       發(fā)射光峰值（ηm）
FITC            488                      525（綠）
PE              488                      575（橙紅）  
PI              488                      630（橙紅）
ECD             488                      610（紅）
CY5             488                      675（深紅）
PreCP           488                      675（深紅）
    各種熒光信號由各自的光電倍增管（PMT） 接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡蟠鎯υ诹魇郊毎麅x的計算機硬盤或軟盤內(nèi).見圖12.2光學(xué)系統(tǒng)和信號檢測系統(tǒng)示意圖。

信號存儲、顯示、分析系統(tǒng)

（一） 信號存儲
存儲在流式細胞儀的計算機硬盤或軟盤內(nèi)的數(shù)據(jù)一般是以List mode（列表排隊）方式存入的,采用List mode方式有兩大優(yōu)點:①節(jié)約內(nèi)存和磁盤空間②易于加工處理分析。
（二）信號顯示和分析
由于List mode方式數(shù)據(jù)缺乏直觀性，數(shù)據(jù)的顯示和分析一般采用一維直
方圖（圖12.3）、二維點陣圖（圖12.4,12.5）、等高線圖（圖12.8）和密度圖（圖12.7）。
     1．單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細胞的每一個單參數(shù)測量數(shù)據(jù)用直方圖來顯 示，圖中橫坐標(biāo)表示散射光或熒光信號相對強度值，其單位是道數(shù)，可以是線性的，也可以是對數(shù)的；縱坐標(biāo)表示細胞數(shù)。見圖12.3一維直方圖，圖中橫坐標(biāo)是FITC熒光信號相對強度值（對數(shù)），縱坐標(biāo)表示細胞數(shù);圖中已根據(jù)陰性對照設(shè)定適當(dāng)?shù)?ldquo;門”（直線門），儀器的計算機就會給出測定值（包括陽性細胞%和平均熒光強度）。

2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細胞的雙參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量的關(guān)系用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。如圖12.4二維點陣圖，是正常人外周血白細胞的前向散射光（FS）和側(cè)向散射光（SS）組成的點陣圖，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是線性的，圖中淋巴細胞、單核細胞、粒細胞很明顯地分為3群，可以很容易地圈“門”（ Bitmap，無定型門），分析各亞群細胞的數(shù)據(jù);圖12.6假三維地形圖（X軸: SSC ,Y軸:FSC Z軸:細胞數(shù)）更清楚地表明這一點。圖12.5二維點陣圖是細胞的兩種熒光（FITC和RD1）雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是對數(shù)的，橫坐標(biāo)代表FITC，縱坐標(biāo)代表PE，圖中已設(shè)定適當(dāng)?shù)?ldquo;門”（十字門），十字門的D1、D2、D3、D4門分別代表PE單陽性細胞、PE和FITC雙陽性細胞 、陰性細胞、FITC單陽性細胞。儀器的計算機就會給出兩種熒光測定值（包括陰性細胞%、兩種熒光各自的陽性細胞%、兩種熒光的雙陽性細胞%、各群細胞的平均熒光強度）。 圖12.7和圖12.8分別是測定細胞的兩種熒光雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖和等高線圖，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表一種熒光參數(shù)，同理只要設(shè)定十字門就可得到兩種熒光的各種測定值，密度圖和等高線圖較點陣圖更直觀。
   3．三參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細胞的三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量的關(guān)系每兩個數(shù)據(jù)組成一對（三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細胞數(shù)量每兩個數(shù)據(jù)可組成6對數(shù)據(jù)）用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。三個熒光數(shù)據(jù)關(guān)系用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個數(shù)據(jù)（如用ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。見圖12.9 prism，圖12.9為人外周血淋巴細胞亞群測定結(jié)果的分光圖，圖中給出CD3、CD4、CD8組合的各種結(jié)果，如T輔助細胞（CD3+CD4+CD8-）為42.0%,如T抑制細胞（CD3+CD4+CD8-）為17.4%。

圖12.5兩種熒光的二維點陣圖（采自Coulter Operaters Guide） 
   圖12.7. 雙參數(shù)數(shù)據(jù)的密度圖（采自Coulter Operaters Guide）      
   圖12.6假三維地形圖和二維點陣圖（采自Coulter Operaters Guide）
   圖12.8雙參數(shù)數(shù)據(jù)的等高線圖（采自Coulter Operaters Guide）
   圖12.9 分光圖（prism）

細胞分選系統(tǒng)

 如在細胞流動室上裝有超聲壓電晶體,通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動，可帶動細胞流動室高頻震動,使細胞流動室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴, 每秒鐘形成液滴上萬個。每個液滴中包含著一個樣品細胞,液滴中的細胞在形成液滴前已被測量,如符合預(yù)定要求則可被充電,在通過偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時向左或向右偏轉(zhuǎn)被收集在容器中,不含細胞液滴或細胞不符合預(yù)定要求液滴不被充電亦不發(fā)生偏轉(zhuǎn)進入中間廢液收集器中,從而實現(xiàn)了分選。分選的詳細原理和操作請有興趣者參考有關(guān)文獻。